Editor di basi di citosina migliorati generati da varianti TadA

Nature Biotechnology volume 41, pagine 686–697 (2023) Citare questo articolo

12k accessi

4 citazioni

50 Altmetrico

Dettagli sulle metriche

Gli editor di base della citosina (CBE) consentono mutazioni di transizione genomica programmabili da C·G a T·A e tipicamente comprendono un enzima CRISPR–Cas modificato, una citidina deaminasi naturale e un inibitore della riparazione dell'uracile. Studi precedenti hanno dimostrato che i CBE che utilizzano la citidina deaminasi naturale possono causare una deaminazione non guidata della citosina a livello dell'intero genoma. Sebbene siano stati successivamente segnalati CBE migliorati che riducono i fuori target stocastici a livello dell'intero genoma, questi editor possono soffrire di prestazioni non ottimali rispetto al target. Qui riportiamo la generazione e la caratterizzazione di CBE che utilizzano varianti ingegnerizzate di TadA (CBE-T) che consentono un elevato raggiungimento del target da C·G a T·A attraverso un insieme di loci genomici con sequenza diversa e dimostrano una robusta attività nelle cellule primarie e non causano aumenti rilevabili nella mutazione dell'intero genoma. Inoltre, riportiamo gli editor di base di citosina e adenina (CABE) che catalizzano sia l'editing da A a I che da C a U (CABE-T). Insieme agli ABE, CBE-T e CABE-T consentono l'installazione programmabile di tutte le mutazioni di transizione utilizzando varianti TadA evolute in laboratorio con proprietà migliorate rispetto ai CBE precedentemente riportati.

Gli editor di basi della citosina (CBE) sono enzimi di modifica genetica in grado di introdurre in modo programmatico cambiamenti della coppia di basi C·G-to-T·A nel DNA genomico delle cellule viventi. Questa conversione chimica si ottiene attraverso la deaminazione idrolitica mediata da enzimi della citosina in uracile, che viene interpretato come timina dalle DNA polimerasi1. Ad oggi, i CBE sono tipicamente composti da quattro componenti distinti: una citidina deaminasi naturale (come APOBEC, AID o CDA)2, una forma alterata di Cas9 in grado di intaccare il filamento di DNA non modificato con base, una o più unità del peptide inibitore dell'uracile glicosilasi (UGI) e una sequenza di localizzazione nucleare (NLS)1,2,3. Questi componenti sono tipicamente fusi in modo covalente ma possono anche essere assemblati in modo non covalente4. I CBE sono stati ampiamente sfruttati per la reversione genetica e l'ingegneria cellulare e hanno il potenziale per fornire benefici terapeutici ai pazienti che vivono con malattie genetiche debilitanti o neoplasie5.

Sebbene sia possibile ottenere un'elevata efficienza di editing del DNA sul target con gli attuali strumenti di editing di base CBE2, questi possono anche causare modifiche fuori target a livello di genoma, stocastiche, indipendenti dall'RNA guida (gRNA)6,7. È stato segnalato che gli editor CBE di nuova generazione come YE1 (rif. 8), BE4-PpAPOBEC9 e altri10 mitigano i risultati fuori target indipendenti dal gRNA, ma questi editor utilizzano varianti naturali o leggermente ingegnerizzate della deaminasi APOBEC e possono soffrire di una diminuzione -prestazioni di editing target2,9. Inoltre, in alcuni contesti sequenza-specifici, i CBE basati su APOBEC possono portare a modifiche prossimali adiacenti alla sequenza genomica target a causa della capacità inefficiente, ma misurabile, di APOBEC di accettare DNA a doppio filamento (dsDNA) come substrato11.

Gli editor di base dell'adenina (ABE) sono enzimi di modifica genetica che installano in modo programmatico mutazioni puntiformi da A·T a G·C in loci mirati tramite una deaminasi TadA evoluta in laboratorio che converte chimicamente l'adenina in inosina12. Le basi dell'inosina si accoppiano con la citosina all'interno del sito attivo delle DNA polimerasi determinando una mutazione da inosina a guanina in seguito alla replicazione del DNA. In particolare, gli ABE provocano fuori target da pochi o nessun gRNA indipendenti e modificano il DNA genomico (gDNA) all'interno di una finestra più precisa (posizioni ~ 3–8, PAM 21–23), il che può comportare un minor numero di fuori target dipendenti dalla guida come così come meno modifiche da parte degli spettatori, rispetto ai CBE6,13. Inoltre, non è stato segnalato che gli ABE agiscano sul dsDNA.

Per conferire gli attributi favorevoli degli ABE a un CBE, abbiamo immaginato di trasformare TadA in un enzima capace di una robusta deaminazione della citidina e successivamente generato una classe migliorata di CBE che utilizza TadA invece di una citidina deaminasi naturale. È incoraggiante che indagini precedenti abbiano dimostrato la malleabilità degli ABE verso un editing da C a T basso ma rilevabile attraverso l'inclusione di UGI14. Infatti, attraverso la progettazione guidata dalla struttura, è stata segnalata una variante ABE, ABE-P48R-UGI, che ha consentito una maggiore attività della citosina, rispetto a ABE7.10, ma con elevata specificità della sequenza TC15. Sebbene questi progressi rappresentassero progressi verso i nostri obiettivi, abbiamo riconosciuto che sarebbero necessarie ulteriori ingegnerizzazioni ed evoluzioni di TadA per ottenere efficienze di editing C·G-T·A terapeuticamente rilevanti con elevata purezza del prodotto e senza restrizioni sulla sequenza del substrato.