Diminuzione della sensibilità del Plasmodium falciparum sia alla diidroartemisinina che alla lumefantrina nell'Uganda settentrionale

Nature Communications volume 13, numero articolo: 6353 (2022) Citare questo articolo

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La resistenza parziale all'artemisinina può facilitare la selezione di Plasmodium falciparum resistenti ai farmaci partner della terapia di combinazione. Abbiamo valutato 99 isolati di P. falciparum raccolti nel 2021 dall’Uganda settentrionale, dove sono emerse mutazioni PfK13 C469Y e A675V associate alla resistenza, e dall’Uganda orientale, dove queste mutazioni sono rare. Con il test di sopravvivenza dell'anello ex vivo, gli isolati con la mutazione 469Y (sopravvivenza mediana 7,3% per mutante, 2,5% misto e 1,4% wild type) e/o mutazioni in Pfcoronin o falcipain-2a, hanno avuto una sopravvivenza significativamente maggiore; tutti gli isolati con sopravvivenza >5% presentavano mutazioni in almeno una di queste proteine. Con test di inibizione della crescita ex vivo, la sensibilità alla lumefantrina (IC50 mediana 14,6 vs. 6,9 nM, p < 0,0001) e alla diidroartemisinina (2,3 vs. 1,5 nM, p = 0,003) era diminuita nell'Uganda settentrionale rispetto a quella orientale; 14/49 isolati settentrionali rispetto a 0/38 isolati orientali avevano un IC50 di lumefantrina > 20 nM (p = 0,0002). Il sequenziamento mirato di 819 isolati dal 2015 al 2021 ha identificato polimorfismi multipli associati ad alterata sensibilità ai farmaci, in particolare PfK13 469Y con ridotta sensibilità alla lumefantrina (p = 6 × 10−8) e mutazioni PfCRT con resistenza alla clorochina (p = 1 × 10−20) . I nostri risultati sollevano preoccupazione per quanto riguarda l’attività dell’artemetere-lumefantrina, l’antimalarico di prima linea in Uganda.

La resistenza ai farmaci ha messo a dura prova per decenni il trattamento e il controllo della malaria da falciparum1. Una resistenza parziale alle artemisinine, i farmaci più importanti oggi utilizzati per il trattamento della malaria, è stata identificata nel sud-est asiatico circa 15 anni fa2,3. Il fenotipo di resistenza parziale comporta una ritardata eliminazione dei parassiti dopo il trattamento di pazienti con artemisinine4 o una maggiore sopravvivenza dei parassiti in coltura dopo l'esposizione alla diidroartemisinina (DHA)5. È stato dimostrato che la resistenza parziale nel sud-est asiatico è associata a una qualsiasi delle circa 20 mutazioni candidate o convalidate nel dominio dell'elica della proteina P. falciparum kelch 13 (PfK13)6,7. Ulteriori polimorfismi hanno accompagnato le mutazioni di PfK13 nei parassiti del sud-est asiatico resistenti all'artemisinina,8,9 e la selezione in vitro di parassiti africani con DHA ha portato a una clearance ritardata associata a mutazioni nella coronina di P. falciparum (Pfcoronin)10. Mutazioni di PfK13 validate come mediatori della resistenza nel sud-est asiatico sono state segnalate in alcune altre parti del mondo11,12,13, ma fino a poco tempo fa mancavano prove di una prevalenza sostenuta di queste mutazioni o di resistenza clinica o in vitro documentata14. Di grande preoccupazione è stata la potenziale comparsa o diffusione della resistenza in Africa, dove si registra la maggior parte della morbilità e mortalità della malaria15. Recentemente, mutazioni PfK13 precedentemente legate alla resistenza parziale all'artemisinina in Asia sono state descritte in Africa orientale, con l'emergere della mutazione PfK13 R561H in Ruanda16,17,18 e delle mutazioni C469Y e A675V nell'Uganda settentrionale19,20,21,22. In studi limitati è stato dimostrato che le mutazioni C469Y, R561H e A675V si associano alla resistenza parziale all'artemisinina misurata clinicamente (clearance ritardata) o in vitro (sopravvivenza migliorata)17,22, ma la nostra comprensione degli impatti del P. falciparum recentemente emerso mutazioni sulla sensibilità ai farmaci e sull’efficacia terapeutica delle principali terapie combinate a base di artemisinina (ACT) in Africa sono incomplete.

Gli ACT combinano un'artemisinina ad azione rapida più un farmaco partner ad azione più lenta23. Nel sud-est asiatico, l’emergere di una resistenza parziale all’artemisinina è stata seguita da prove di una ridotta attività antimalarica dei farmaci partner di ACT, meflochina24 e piperachina25. In particolare, la resistenza alle artemisinine, associata principalmente alla mutazione PfK13 580Y, e alla piperachina, associata a nuove mutazioni in PfCRT e all'amplificazione del gene plasepsina 2/3, ha portato a tassi di fallimento per DHA-piperachina > 50% in Cambogia26,27,28. La recente comparsa di una resistenza parziale alle artemisinine nell'Africa orientale potrebbe portare alla selezione di parassiti con ridotta sensibilità ai farmaci partner di ACT. Considerando il massiccio numero di vittime della malaria in Africa, questa conseguenza potrebbe essere devastante, come si è visto con l’emergere della resistenza alla clorochina negli anni ’80, portando a milioni di morti per malaria in eccesso29.

20 nM (p = 0.0002; Fig. 2). RSAs, which entailed counting parasites 72 h after initiation of a 6 h DHA pulse, did not show significant differences in survival between isolates from northern (median 2.5% survival for 52 samples) and eastern (median 1.4% survival for 29 samples; p = 0.53) Uganda, but of note some parasites with PfK13 mutations associated with delayed parasite clearance were present at both sites (Fig. 2)./p>5% had either the PfK13 469Y mutation, mutations in falcipain-2a, or both. Interestingly, mutations in PfK13 outside the propeller domain were associated with decreased RSA survival (the opposite of the effect of PfK13 469Y); considering any of 15 non-propeller mutations identified, survival was 1.5% in 42 mutant vs. 5.5% in 26 fully wild type isolates (p = 0.02; Supplementary Table 2). Two other polymorphisms with significant independent associations were deletion in a putative ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 1, associated with increased RSA survival, and a SNP in a gene encoding a protein of unknown function, associated with decreased survival./p>30 nM (median IC50 39.5 nM), subsequent IC50 values measured after culture for 4 or more weeks and then after freezing, thawing, growth in culture, and repeat assays, were generally lower than the initial ex vivo values (Table 5). However, after culture adaptation IC50 values for these eight northern Uganda isolates measured before (median IC50 13.2 nM) or after (median IC50 16.9 nM assessed in Uganda and 7.4 nM assessed in the USA) freeze-thaw-reculture were above values for parasites collected from eastern Uganda for direct comparison with the northern Uganda isolates (median IC50 6.9 nM for 38 isolates) or for a larger set of isolates published earlier (median IC50 5.1 nM for 365 isolates32)./p>5% despite lack of the PfK13 469Y mutation had mutations in falcipain-2a. Of the 17 mutations identified in falcipain-2a, 11 were also identified in isolates from southeast Asia in which falcipain-2a haplotypes were associated with enhanced RSA survival9. Falcipain-2a is a hemoglobinase that plays a key role, in concert with other proteases, in hydrolyzing hemoglobin to supply amino acids for parasite metabolism43. Loss of falcipain activity due to treatment with specific inhibitors or gene knockout markedly blunted the antimalarial activity of DHA, indicating that falcipain-mediated proteolysis of hemoglobin is needed for efficient activation of artemisinins44. These results are consistent with our understanding that the conversion of artemisinins by heme, after liberation from hemoglobin, into toxic free radicals, is a prerequisite to efficient action of artemisinins45. Interestingly, a mutation encoding a falcipain-2a stop codon was identified in parasites selected in vitro for resistance to artemisinin, but this selection occurred after emergence of a PfK13 mutation6. Taken together, available data suggest that certain mutations in falcipain-2a can mediate artemisinin partial resistance independent of or in concert with mutations in PfK13./p>1% parasitemia were diluted to 1%; isolates with ≤1% parasitemia were cultured at starting parasitemias. The cells were washed to remove drug after 6 h, and culture was continued for an additional 66 h. At 72 h after culture initiation, Giemsa-stained thin smears were prepared. Cultures were considered viable and appropriate for assessment if control parasitemia was ≥0.2% and also ≥25% of the starting parasitemia. Parasitemias were counted in control and treated cultures, and RSA survival was expressed as the proportion of viable parasites in the DHA treated cultures relative to controls./p>15%) prevalence of minor alleles were evaluated independently, as described above, and loci with low (≤15%) minor allele prevalence were analyzed as aggregate variables, in which the presence of any minor allele was compared with the major allele. For both high and low prevalence loci, p ≤ 0.05 were considered significant. For loci that were statistically significant, RSA survival was also evaluated in the context of K13 C469Y and A675V mutations. Candidate loci and K13 genotypes were treated as binary variables as described above./p>